Via het PPS project ‘On-site plantpathogeen detectie voor plantgezondheid en fytosanitaire controle’ werken onderzoekers en bedrijven aan het ontwikkelen van nieuwe detectiemethoden voor onder andere bacteriën, schimmels en virussen (plantpathogenen). De uitdaging was niet alleen het testen op locatie (on-site) voor deze organismen, maar ook het testen op meerdere organismen in één reactie en de bruikbaarheid van een snel sequencing systeem te onderzoeken.
In het deelproject ‘On-site en Barcoding’, dat onlangs is afgerond, zijn daarvoor:
- snelle DNA/RNA extractie protocollen uit bladeren van verschillende gewassen opgesteld en uitgetest;
- voor diverse plantenpathogeen on-site LAMP testen ontwikkeld en uitgetest op besmette planten;
- methoden ontwikkeld en uitgetest om 6 verschillende tobamovirussen m.b.v. het snelle MinION sequencing systeem te detecteren in bladeren.
Het vroegtijdig herkennen van ziekteverwekkers van planten is belangrijk voor een handelsland als Nederland. Door snel maatregelen te kunnen nemen, kan verdere verspreiding van ziekten en plagen worden voorkomen evenals oponthoud en beperkingen bij de im- en export van plantmateriaal. Er is daarom behoefte aan snelle, accurate en efficiënte on-site detectiemethoden.
De toenemende handel in land- en tuinbouwproducten, toename van reizigers en klimaatverandering veroorzaken een steeds groter risico op het verspreiden van ongewenste organismen. Daarom is controle van deze goederen- en reizigersstromen op de aanwezigheid van ongewenste organismen gewenst. Hierdoor neemt de vraag naar snelle, efficiënte en accurate on-site detectiemethoden om ziekten en plagen te kunnen herkennen toe. De tot nu toe ontwikkelde on-site testen op plantpathogenen zijn allemaal enkelvoudig in gebruik. Dat wil zeggen dat ze geschikt zijn voor het testen op één enkele ziekteverwekker. Ziekteverwekkers in de plant of in andere substraten zijn echter vaak moeilijk of niet herkenbaar. Daarom is er behoefte aan de ontwikkeling van een breed werkende (meervoudige) on-site detectietechnologie. De eindgebruiker hoeft dan geen specifieke test te selecteren.
Doel
De bestaande methode voor extractie van DNA/RNA vereenvoudigen en tegelijkertijd de efficiëntie verbeteren, zodat deze methode ook voor on-site detectie kan worden gebruikt. Het ontwikkelen van een werkbaar format voor snelle, meervoudige on-site toetsen en het ontwikkelen van een methodiek voor het uitvoeren van on-site diagnose aan bekende plantpathogenen door middel van amplicon sequencing.
Aanpak
- Ontwikkeling van een innovatief DNA/RNA-extractieprotocol. Hiervoor wordt uit een aantal geselecteerde substraten (zoals blad, stengel, water, lucht) op een simpele manier DNA/RNA geëxtraheerd.
- Ontwikkelen van een on-site multiplexmethode waarbij gebruik gemaakt wordt van eerder ontwikkelde of in de literatuur beschreven individuele LAMP-testen, waar nodig aangevuld met nieuw te ontwikkelen testen.
- Ontwikkeling van on-site barcode sequencing voor substraten of planten die geen of onduidelijke symptomen vertonen. Hierdoor wordt het mogelijk binnen een aantal uren de DNA-sequentie van unieke regio’s van het genoom van de aanwezige plantpathogenen door het gebruik van Next Gen Sequencing, te identificeren in een bedrijfsomgeving, zonder het gebruik van geavanceerde laboratoriumapparatuur en uitgebreide computerfaciliteiten.
Beoogde resultaten
- Snelle en betrouwbare op DNA gebaseerde test waarbij meerdere pathogenen in één enkele test kunnen worden geïdentificeerd.
- Innovatief on-site detectiesysteem gebaseerd op het bepalen van de DNA/RNA - sequentie van unieke regio’s van het genoom van organismen.
Bovenstaande resultaten zullen leiden tot een significante verbreding van eenvoudige detectietechnologie voor precieze on-site identificatie. Daarnaast wordt het vroegtijdig waarnemen van (bekende en beschreven) ziekteverwekkers van planten op soortniveau in de hele keten mogelijk.